آزمایشگاه میکروبی

در شمارش کلی کپک باید شکلش راببینیم اما در اشیرشیا وجود گاز وحلقه

وکمپلکس تشخیص میدهیم در اشیرشیا آثار میکروارگانیسم را می بینیم .

به اپیدمولوژی باید اهمیت دهیم وآلودگی ثانویه به  نمونه وارد نکنیم از اصول بعدی

استریلیزاسیون است شرایطی مهیا می کنیم که وسایل عاری از میکروارگانیسم

باشند .2نوع استرلیزاسیون داریم : مرطوب وخشک

در مرطوب از اتوکلاو استفاده می کنیم دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 15 پوند

مدت 15-20 دقیقه برای استریزاسیون محیط کشتهاست . در خشک از آون دمای 180

 بمدت 5/1-2 ساعت برای استریل کردن شیشه آلات وپیپت ارلن پلیت وابزارفلزی

استفاده می کنیم .

انکوباتور (فور) : وسیله ای است که در آن دماهای مختلف را تنظیم می کنیم برای

گرمخانه گذاری میکروارگانیسم ها ی کشت داده شده استفاده می شود دماهای

تنظیم شده فور  30   و-35-37  و5/41و 44 و55 درجه سانتی گراد است .

میکروارگانیسم ها برای رشد به چند فاکتور نیاز دارند .1-رطوبت 2- دما 3- پی اچ 4- دما

برای آزمون فرآورده احتیاج به چند چیز داریم :1- استاندارد 2- ابزار لازم 3- محیط

کشت باکتریایی

آزمون آرد   شماره استاندارد 2393

فاکتورهای مورد آزمایش :1- شمارش کلی میکروارگانیسمها 2- کلستریدیوم پرفرانژنس 3- کپک

شمارش کلی میکروارگانیسم ها :

محیط کشت لازم پلیت کانت آگار است که محیطی عمومی برای رشد انواع میکرو

ارگانیسم هاست نکته : اتاق کشت را با الکل 90 درجه در کنار شعله استریل می

کنیم وسایل کار را هم با الکل استریل ی کنیم . محیط کشتهایی هم که درست

میکنیم را قبل از ریختن در پلیت در اتوکلاو استریل می کنیم .

طرز کار :مقدار 10 گرم نمونه را در شرایط سترون به 90 سی سی رینگر استریل

شده اضافه می کنیم (اقرص رینگر به 500 سی سی آب مقطر اضافه می کنیم ودر

یخچال نگهداری می کنیم . ) که این رقت 1/0 میشود از رقت 1/0 مقدار 1 سی سی 

برداشته به 9 سی سی رینگر استریل شده در لوله آزمایش اضافه می کنیم که می

شود رقت 01/0 از این رقت 1 سی سی برداشته وبه 9 سی سی رینگر استریل

شده در لوله آزمایش اضافه می کنیم می شود رقت 001/0از این رقت هم 1 سی

سی برداشته به 9 سی سی رینگر استریل شده در لوله آزمایش اضافه می کنیم

می شود رقت 0001/0.

2 سی سی از رقت 001/0برداشته به دو پلیت خالی به ازای هر پلیت 1 سی سی

اضافه می کنیم و 2 سی سی از رقت 0001/0 برداشته به دو پلیت هر کدام 1 سی

سی اضافه می کنیم بعد بصورت پور پلیت روی محیط کشت پلیت کانت آگار می ریزیم

(محیط کشت را طبق دستور کار روی بر چسبش به میزانی که نیازداریم درست می کنیم ) به شکل 8 هم میزنیم ومیگذاریم ببندد پلیت را واژگون کرده بمدت 72 ساعت  

در دمای 30 درجه قرار می دهیم .

فاکتور دوم کلستریدیوم پر فرانژنس است که محیط کشتی که استفاده می کنیم

دسیکلوسرین است .کلستریدیوم باکتری میله ای گرم مثبت بی هوازی است هاگدار

وبدون حرکت که اسپور آن یا در مرکز یا در انتهاست در دمای 35-37 درجه رشد می

کند آرد چون بصورت کمی محاسبه می شود از محیط کشت اینچرمنت یا غذایی

استفاده نمی شود .

طرز تهیه محیط کشت  سیکلو سرین :به محیط سیکلوسرین یک افزودنی بصورت جدا

اضافه می کنیم که محلول دسیکلو سرین است که برای ساخت این محلول 4/0گرم

آن را وزن می کنیم به 100 سی سی آب مقطر اضافه می کنیم سپس 1 میلی لیتر

از این محلول را به 100 سی سی محیط سیکلوسرین اضافه میکنیم واز این محلول

برای کشت استفاده می کنیم  .نکته : اضافه کردن محلول دسیکلوسرین آگار بعد از

فرآیند اتوکلاوگذاری محیط سیکلوسرین آگار انجام می شود

روش کار 

طرز کشت :از رقت 1/0(همان ارلن ) مقدار 1 سی سی بر میداریم به پلیت اضافه

می کنیم بصورت پور پلیت به آن محیط سیکلوسرین آگارمیریزیم بصورت عدد8 هم

میزنیم بعد از جامد شدن محیط پلیت را واژگون درجار بی هوازی قرار داده ودر انکوباتور

با دمای 37بمدت 24 تا 48 ساعت میگذاریم .

نکته : کلستریدیوم پرفرژنس هوازی نیست باید در جار بی هوازی بگذاریم بعد جاررا

درانکوباتور قرار دهیم .

پس از پایان گرمخانه گذاری چنانچه کلنی دیدیم احتمال وجود کلستریدیوم هست .

آزمون تاییدی :استفاده از محیط لاکتوسولفیت : در لوله آزمایشی که محیط کشت

تری کوبیلات مایع را درست کردیم لوله درهام می اندازیم . باید به هر لوله حاوی

محیط کشت تری کوبیلات مایع یکی از کلنی هایی که در محیط سیکلوسرین آگار زده

شده را اضافه کردودر جار بی هوازی دمای 37 بمدت 24 ساعت قرار می

دهیم .چنانچه محیط حاوی لوله درهام سیاه رنگ شد و گاز در اوله درهام دیدیم

واکنش مثبت است .

کپک  شماره  استاندارد2/10899

محیط کشت مورد استفاده دی کلران 18 درصد گلیسرول است .

نکته :چند روش کشت داریم  1- پورپلیت 2- خطی  درروش اول 1 سی سی از رقت 1

/0برداشته به یک پلیت خالی استریل اضافه می کنیم ومحیط کشت دی جی 18 را

اضافه وپور پلیت می کنیم این کار را درمورد رقت 01/0هم انجام میدهیم .

در روش خطی یا سورفیس : مقدار 1/0 سی سی یا 01/0 روی محیط کشت دی

جی 18 کشت می دهیم محیط کشت را در پلیت ریخته سرد کرده سپس خطی کشت می دهیم

طریقه شمارش : اگر دو پلیت داشتیم که کشت دادیم از رابطه زیر شمارش کلی میکروارگانیسمها انجام می شود.

=شمارش کلی

اما برای شمارش کپک در رابطه روبرو میگذاریم : تعداد کلنی کپک را شمرده *عکس ضریب رقت

فاکتورهای مورد آزمایش نوشابه گازدار    شماره استاندارد 3845

شمارش کلی باکتری های مزوفیل هوازی

باکتری های مقاوم به اسید یا اسید دوست

کپک

مخمر

 های بند 2و3و4 منفی است.                                                              Moحد

مجازیک تا:ده  در هر سی سی نوشابه.

 محیط کشت های مورد استفاده  برای بند اول محیط پلیت کانت آگار است ومحیط

لازم برای اسید دوست ها ارنج سرم آگار یا لاکتوباسیلوس اگار است کپک ومخمر یک

محیط کشت دارند که سابرودکستروز آگار است .

روش کار : درب نوشابه را در شرایط سترون در کنار شعله باز نموده یک سوم تا نیمی

از نوشابه را خارج کرده ودرب نوشابه را محکم بسته وهم میزنیم وگاز را خارج می

کنیم 3 سی سی از نوشابه بدون گاز را در شرایط سترون برداشته به سه پلیت 

منتقل می کنیم بعد محیط کشت پلیت کانت آگار وای جی سی و ا اس آ (ارنج سرم آگار ) را بصورت پور پلیت می افزاییم  مدت زمان مزوفیل بی هوازی  24-48 ساعت دمای 37 درجه است .

باکتری اسموفیل 5 روز در دمای 30 درجه  وکپک ومخمر 5 روز در دمای 25 درجه

است اگر رقت 1/0 در پلیت هیچ کلنی نداشت مینویسیم کمتر از 10بوده است.

آزمون بیسکویت

تعداد فاکتور های آزمون :

1- آنتروباکتریاسه 2- اشیرشیا 3- کپک

محیط کشت برای آنتروباکتریاسه ویولت رد آگار بهمراه 1 گرم گلوکز به ازای 100 سی سی محیط کشت است .

2-اشیرشیا :محیط کشت لوریل سولفات براث است که باید 6/0گرم آن را وزن کنیم به ازای 10 سی سی آب مقطر تا غلظت مضاعف بدست آید.این محیط کشت باید در

لوله آزمایش واجد لوله درهام درست شود

3- کپک : محیط کشت وای جی سی است که به ازای 50 سی سی می شود 1 گرم .

90 سی سی رقیق کننده  در ارلن ریخته سرش را با پنبه وفویل آلومینیوم ببندید و

اتوکلاو کنید . 10 گرم بیسکویت را خرد کنید به رقیق کننده اضافه کنید خوب هم بزنید روی د پلیت وی آر بی آ رقت 1- را مینویسیم  روی روی وای جی سی هم این رقت را

مینویسیم . 1 گرم از محلول حاوی نمونه وذقیق کننده به پلیت خالی محیط کشت

های وی آر بی آ و وای جی سی میریزیم و10 گرم هم در محیط کشت لوریل سولفات براث میریزیم .

تفسیر آزمایش :

پلیت محتوی وی آر بی آ پس از سرد شدن واژگون میکنیم ودر دمای 35 تا 37 بمدت 24

 ساعت گذاشته اگر کلنی ریز صورتی رنگ ظاهر شد آنتروباکتریاسه را نشان می

دهد پلیت محتوی وای جی سی را بمدت 3-5 روز در دمای 25 قرار داده در صورت

رشد کپک تعداد کلنی ریز صورتی رنگ در پلیت ظاهر میشود که نشانه آنتروباکتریاسه است 

پلیت محتوی وای جی سی را بمدت 3-5 روز در دمای 25 قرار داده در صورت رشد

کپک تعداد کلنی را در عکس ضریب رقت ضرب میکنیم 

لوله حاوی محیط لوریل سولفات براث در دمای 35 تا 37 بمدت 24 تا 48 ساعت نگه

داری میشود اگر گاز بود احتمال اشیرشیا هست